TY - THES T1 - Funktionale und molekulare Charakterisierung des akzessorischen HIV 1 Proteins Vpr im Hinblick auf Virus - Wirt Interaktion A1 - Sörgel,Stefan Y1 - 2012/04/27 N2 - Ziel dieser Arbeit war es am Beispiel von HIV-1 die Abhängigkeit der Virusreplikation von zellulären Faktoren zu untersuchen. Die Interaktion viraler Komponenten mit genetisch stabilen Faktoren der Wirtszelle stellt einen bedeutenden Ansatzpunkt für die antiretrovirale Therapie dar. Durch Identifikation und Inhibition zellulärer Schnittstellen können Resistenzbildungen, wie sie in der Behandlung von HIV-1 Infektionen auftreten, vermieden werden. Das akzessorische Protein Vpr stellt in vielen Abschnitten des HIV-1 Replikationszyklus einen Interaktionspunkt zwischen dem Virus und verschiedenen zellulären Komponenten dar und ist daher ein entscheidender Faktor in der Infektion von Zellen der Monozyten/Makrophagen Linie. Diese stellen einen Teil des Virusreservoirs von HIV-1 im Patienten dar, das es zu eliminieren gilt. Der erste Teil dieser Arbeit baut auf vorangegangenen Studien zur Interaktion von HIV-1 CA mit der zellulären peptidyl-prolyl cis/trans Isomerase Cyclophilin A auf. Hier wurde die Replikation von HIV-1 in Zusammenhang mit der Inkorporation von Cyclophilin A in Virionen gebracht. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Replikation einer Cyclophilin A insensitiven HIV-1 Mutante durch die fehlende Interaktion von Cyclophilin A mit Vpr nicht weiter verringert wird. Die Replikation einer Cyclophilin A sensitiven Mutante konnte im verwendeten Zellsystem nicht auf den Einfluss der Vpr-Cyclophilin A Interaktion getestet werden. Der zweite Teil dieser Arbeit beschäftigt sich mit der Lokalisation von Vpr an der nukleären Membran der Wirtszelle und deren Einfluss auf die Induktion des für die Replikation von HIV-1 notwendigen Zellzyklusarrests in der G2 Phase. Konfokale Mikroskopiestudien belegten, dass die Lokalisation von Vpr an der Kernmembran spezifisch durch die Aktivität der zellulären Caspase 3 gesteuert wird. Eine Inhibition der Caspase 3 hatte die Akkumulation von Vpr an der Kernmembran zur Folge. Die Anreicherung von Vpr an der nukleären Membran in wt HIV-1 infizierten T-Zellen nach Caspase 3 Inhibition führte selektiv zu einer gesteigerten Induktion des Vpr abhängigen G2 Zellzyklusarrests. Die Sensitivität von Vpr gegenüber der Caspase 3 Aktivität steht dabei in Abhängigkeit zu der Integrität der N-terminalen Helix ?-1. Eine verringerte Induktion der Apoptose durch Vpr nach Caspase 3 Inhibition bei gleichzeitiger Erhöhung des G2 Zellzyklusarrests propagiert die funktionelle Trennung der beiden Funktionen des akzessorischen Proteins. Der selektive Einfluss der Caspase 3 Inhibition auf die Lokalisation von Vpr und die Apoptoseinduktion wurde durch Versuche zur Stabilität und Virion-Inkorporation von Vpr bestätigt. Beide Funktionen zeigen sich insensitiv gegenüber Inhibitoren von Caspase 3. Eine Auswirkung der Caspase 3 Aktivität auf die HIV-1 Virusreplikation konnte im Zuge dieser Arbeit sowohl in PBMCs als auch in Makrophagen nicht gezeigt werden. Der letzte Teil dieser Arbeit untersucht die Freisetzung neu synthetisierter HIV-1 Partikel aus der Wirtszelle in Abhängigkeit der L-Domänen Aktivität von HIV-1 p6. Durch Überexpression des zellulären Faktors ALIX und dessen Bindung an die sekundäre YPXnL-Domäne, welche mit dem Vpr-Bindemotiv in p6 überlappt, konnte der Phänotyp einer Deletion der primären PTAP-Domäne in HIV 1 revidiert und somit dieser Mechanismus bestätigt werden. Die Virusfreisetzung und Infektiosität der Mutante waren nach ALIX Überexpression annähernd vergleichbar mit der Wildtyp Variante. Die in den Vorversuchen generierten und getesteten Mutanten konnten anschließend in infektiöse und nicht infektiöse Vektorsysteme kloniert werden. In weiterführenden Versuchen wurde die Funktion von ALIX in der HIV-1 Freisetzung in Abhängigkeit zu der zellulären RING Finger E3 Ubiquitinligase POSH gebracht. Durch Ubiquitinylierung von ALIX durch POSH wurde der Effekt von ALIX auf die Virusfreisetzung einer HIV-1?PTAP Mutante deutlich verstärkt. KW - HIV KW - Cyclophilin KW - Zellzyklus KW - Apoptosis KW - Kernhülle CY - Erlangen PB - Universitätsbibliothek der Universität Erlangen-Nürnberg AD - Universitätsstraße. 4, 91054 Erlangen L2 - http://www.opus.ub.uni-erlangen.de/opus/volltexte/2012/3245 ER -