TY  - THES
T1  - Funktionelle Charakterisierung des Typ III-Effektors XopJ aus Xanthomonas campestris pv. vesicatoria
A1  - Bartetzko,Verena
Y1  - 2012/10/11
N2  - Xanthomonas campestris pv. vesicatoria (Xcv) ist der Erreger der bakteriellen Fleckenkrankheit in Tomaten (Solanum lycopersicum) und Paprika (Capsicum annuum). Bei Xanthomonas handelt es sich um ein biotrophes Pathogen, das auf lebende Wirtszellen angewiesen ist. Die Krankheit a?ußert sich in Bla?ttern durch wassergefu?llte La?sionen und Hypertrophie der Mesophyllzellen. Wa?hrend der Besiedlung einer Pflanze injiziert Xanthomonas campestris pv. vesicatoria mehr als 30 Effektorproteine u?ber das Typ III-Sekretionssystem in das Zytosol der Pflanzenzelle. Dort ko?nnen Effektoren die Krankheit fo?rdern, indem sie einerseits den Stoffwechsel des Wirtes zu ihren Gunsten umlenken und andererseits indem sie die Abwehrantworten des Wirtes inhibieren. Hierbei spricht man von einer kompatiblen Interaktion. Allerdings ko?nnen Pflanzen auch einige Effektoren durch spezialisierte Resistenzproteine erkennen und zur Einda?mmung des Bakterien- wachstums eine hypersensitive Reaktion (HR), gefolgt von lokalem Zelltod, induzieren. Hierbei handelt es sich um die Effektor-vermittelte Immunita?t (ETI: effector triggered immunity) und eine inkompatible Interaktion.
Im Rahmen dieser Arbeit konnte das Effektorprotein XopJ aus Xanthomonas campestris pv. vesicatoria funktionell weiter charakterisiert werden. Bei XopJ handelt es sich um einen Typ III-Effektor der YopJ-Familie, die sowohl in tier- als auch in pflanzenpathogenen Bakterien verbreitet ist. Transiente Expression eines XopJ-GFP-Fusionsproteins zeigte eine Lokalisierung des Effektors an der Plasmamembran der Pflanzenzelle. Mutationsanalysen legten weiterhin nahe, dass diese Lokalisierung durch eine Myristoylierung und wahrscheinlich auch durch eine Palmitoylierung am N-Terminus des Proteins vermittelt wird. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass XopJ die Sekretion eines GFP-Reporterproteins (secGFP) in den Apoplasten hemmt und daru?ber hinaus die durch PAMPs (pathogen-associated molecular pattern) ausgelo?ste Ablagerung von Kallose an der Zellwand unterdru?ckt. Diese Ergebnisse deuteten darauf hin, dass XopJ Teile der Zellwand-assoziierten basalen Abwehr in Pflanzen unterdru?cken kann. Diese Virulenzfunktionen waren sowohl von einer intakten katalytischen Triade des Effektors, als auch von einem funktionalen Myristoylierungssignal abha?ngig. Unter Einsatz des Hefe-Zwei-Hybrid-Systems wurde RPT6 als ein mo?glicher Interaktionspartner von XopJ in Pflanzen identifiziert. Die Interaktion zwischen XopJ und RPT6 konnte auch in planta sowohl durch Koimmunpra?zipitations- als auch durch Bimolekulare Fluoreszenzkomplementationsexperimente besta?tigt werden. RPT6 ist Bestandteil der regulatorischen 19 S-Untereinheit des 26 S-Proteasoms in Eukaryoten.
Die Messung der Proteasomaktivita?t in transient XopJ-exprimierenden Bla?ttern zeigte, dass die Interaktion des Effektors mit RPT6 zu einer Hemmung der Proteasomaktivita?t und zur Akkumulation ubiquitinierter Proteine in der Pflanzenzelle fu?hrt. Dieser Effekt war wiederum abha?ngig von einer intakten katalytischen Triade und der Myristoylierung des Effektors. Durch Verwendung einer Xcv xopJ-Verlustmutante konnte gezeigt werden, dass XopJ wahrscheinlich fu?r die Reduzierung der Proteasomaktivita?t wa?hrend einer kompatiblen Interaktion mit Paprika verantwortlich ist. Diese Daten deuteten darauf hin, dass XopJ mo?glicherweise durch Verminderung der Proteasomaktivita?t Abwehrreaktionen der Pflanze unterdru?ckt und impliziert eine Rolle des Proteasoms in der basalen Abwehr von Pflanzen.
Um die Wirkungsweise von XopJ biochemisch zu untersuchen, wurde in E. coli exprimiertes XopJ auf eine mo?gliche Acetyltransferaseaktivita?t hin getestet. Allerdings konnten diese Experimente eine enzymatische Aktivita?t von XopJ bisher nicht belegen, obwohl die Mutation eines in den mo?glichen katalytischen Mechanismus involvierten Lysinrestes im XopJ-Polypeptid die Interaktion mit RPT6 und auch den Hemmeffekt auf das Proteasom unterbindet. Insofern bleibt die biochemische Funktion von XopJ im Moment noch unklar.
Die Behandlung von XopJ-exprimierenden Bla?ttern von Nicotiana benthamiana mit Salicylsa?ure (SA) fu?hrte zur Auslo?sung einer HR. Herunterregulierung von Komponenten der R-Protein-vermittelten Reaktion mittels Virus-induzierter Gen-Stilllegung (VIGS) legen die Beteiligung eines R-Proteins an der Auslo?sung der HR nahe. Außerdem wurde die Rolle einiger Komponenten des SA-Signaltransduktionsweges bei der Auslo?sung der HR nach XopJ-Expression untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, dass die HR unabha?ngig von NPR1, RAR1 und EDS1 war. In EDS1-herunterregulierten Pflanzen wurde eine HR auch in Abwesenheit von SA ausgelo?st.
KW  - Xanthomonas campestris vesicatoria
KW  - Proteasom
KW  - Phytopathologie
KW  - Myristoylierung
KW  - Proteintransport
CY  - Erlangen
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L2  - http://www.opus.ub.uni-erlangen.de/opus/volltexte/2012/3566
ER  -