Hinweis zum Urheberrecht
Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:bvb:29-opus-16427
URL: http://www.opus.ub.uni-erlangen.de/opus/volltexte/2010/1642/
Expression of Lymphatic Endothelial Cell (LEC) Markers in the Human Eye
Expression von lymphendothelialen Zellmarkern (LEZ) im Humanen Auge
Birke, Kerstin
| Originalveröffentlichung: |
| (2010) Invest Ophthalmol Vis Sci. 2010 Jan;51(1):344-54. Epub 2009 Sep 8. |
| pdf-Format:
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| SWD-Schlagwörter: |
| Auge , Chemokine |
| Freie Schlagwörter (Deutsch): |
| Immunprivileg , Migration von APZ , Podoplanin |
| Freie Schlagwörter (Englisch): |
| Immune privilege , migration of APCs , Podoplain |
| Fakultät: |
| Naturwissenschaftliche Fakultät |
| Fakultät: |
| Naturwissenschaftliche Fakultät |
| DDC-Sachgruppe: |
| Biowissenschaften, Biologie |
| Dokumentart: |
| Dissertation |
| Hauptberichter: |
| Brandstätter, Johann Helmut (Prof.) |
| Sprache: |
| Englisch |
| Tag der mündlichen Prüfung: |
| 08.02.2010 |
| Erstellungsjahr: |
| 2010 |
| Publikationsdatum: |
| 23.02.2010 |
| Kurzfassung in Deutsch: |
| Das Auge ist immunologisch privilegiert, d.h. Transplantate können über längere Zeit in der Augenvorderkammer verbleiben ohne abgestoßen zu werden. Streilein zeigte, dass eine allergische Reaktion vom verzögerten Typ nach subkutaner Antigeninjektion aus-bleibt, wenn das gleiche Antigen zuvor in die Augenvorderkammer injiziert wurde, ein Phänomen, das er als „anterior chamber associated immune deviation“ (ACAID) be-zeichnete. Nach Streilein ist ACAID nur dann auslösbar, wenn Antigen präsentierende Zellen (APZ) den vorderen Augenabschnitt über das Trabekelwerk verlassen, von wo sie über den venösen Abfluss, unter Umgehung regionärer Lymphknoten, direkt zur Milz gelangen, wo die systemische Toleranz gegenüber den okulären Antigenen induziert wird.
Ziel der vorliegenden Arbeit war es zu untersuchen, auf welche Weise APZs im Auge zu den entsprechenden Abflusswegen geleitet werden. In anderen Organen übernehmen Lymphendothelien durch Sekretion chemotaktischer Chemokine diese Aufgabe. Im Auge fehlen Lymphgefäße, daher wurde untersucht, ob die Gewebe des vorderen Augenab-schnittes Funktionen im Sinne einer aktiven Beteiligung an einem entsprechenden Trans-portmechanismus übernehmen. Dazu wurde die Expression der Lymphendothelmarker VEGFR3, Prox-1, Lyve-1 und Podoplanin, sowie der chemoattraktiven Chemokine Ccl19, -20, und -21 und deren entsprechenden Rezeptoren CCR6 und -7 durch PCR-Analysen an Iris und Trabekelwerkgewebe untersucht. Der Proteinnachweis und die Lo-kalisation wurden durch Immunfluoreszenzfärbungen an Schnitten humaner und muriner vorderer Augenabschnitte untersucht. Kammerwasserproben junger, ACAID-defizienter DBA/2J Mäuse und älterer DBA/2J Mäuse, bei denen ACAID induzierbar ist, wurden in Chemokin-Proteinarray-Analysen mit Proben gleichaltriger Kontrolltiere verglichen.
Lyve-1 war ausschließlich auf isolierten dendriformen Zellen im Irisstroma, im Ziliarköper und in den intertrabekulären Poren nachweisbar. Innerhalb der Iris waren die Lyve-1+ Zellen gehäuft in Kapillarnähe lokalisert. Ein signifikanter Teil der Zellen koexprimierte den Makrophagenmarker CD68. Einzelne Zellen im Irisstroma exprimierten auch Po-doplanin (Pdpn), wobei die Mehrzahl der Pdpn+ Zellen Lyve-/CD68- war. Eine deutliche Markierung für Pdpn zeigte sich an den Zellen der Irisvorderfläche, den Zellen des Tra-beculum ciliare und besonders ausgeprägt an den Trabekelwerkszellen. Prox-1 wurde nur auf transkriptioneller Ebene in Trabekelwerks- und Irisgewebe nachgewiesen, während VEGFR3 weder durch Färbungen noch durch PCR Analysen nachweisbar war. Das mig-rationsassoziierte Chemokin Ccl21 wurde sowohl an der Irisvorderfläche als auch im Trabekelwerk bzw. an in vitro kultivierten Trabekelwerkszellen nachgewiesen, wo es eine deutliche Kolokalisation mit Pdpn zeigte. Der entsprechende Rezeptor CCR7 wurde aus-schließlich an dendriformen Zellen an der Irisvorderfläche gefunden, die Lyve-1+/Pdpn- waren. CCR6+ Zellen wurden im Irisstroma ähnlich den Lyve-1+ Zellen in der Nähe von Blutgefäßen detektiert. Die Expression des entsprechenden Liganden Ccl20 wurde dispers im Irisstroma und um den Schlemm Kanal, inklusive der cribriformen Region des Tra-bekelwerkes, gefunden. In Mausirides ergab sich zusätzlich eine deutlich erhöhte Expression an der Irisrückfläche.
Chemokin-Proteinarray Analysen von Kammerwasserproben von jungen ACAID-defizienten DBA2/J Mäusen ergaben, dass in diesen Proben acht Chemokine, unter ande-rem Ccl19 und Ccl20, signifikant erhöht waren. Kammerwasserproben älterer DBA/2J Mäuse, in denen nach Literaturangaben ACAID auslösbar ist, zeigten im Vergleich zu alterskorrelierten Kontrollen keine Auffälligkeiten.
Die Analyse der intrazellulären Expression von Pdpn in kultivierten Trabekelwerkszellen ergab eine filament-ähnliche Verteilung vergleichbar mit der von Komponenten des Zy-toskeletts. Doppelfärbungen mit den Zytoskelettmarkern Aktin, Tubulin und Vimentin zeigten eine deutliche Assoziation von Pdpn mit diesen Markern. Darüber hinaus wurde Pdpn außerhalb der Gewebe der Vorderkammer in den Müllerzellen der Retina nach-gewiesen.
Diese Ergebnisse deuten an, dass Pdpn an der Irisvorderfläche sowie den Eintrittsberei-chen der Kammerwasserabflusswege die chemoattraktiven Chemokine Ccl19, -20 und -21 bindet und dadurch die Migration von CCR6+ bzw. CCR7+ dendriformen Zellen reguliert. Die im Vergleich zum uveoskleralen Abfluss deutlich höhere Expression im Trabekelwerk könnte Grundlage für einen bevorzugten Austritt über den konventionellen Abfluss sein und damit eine wichtige Rolle für das okuläre Immunprivileg spielen. Änderungen des Chemokinspiegels im Kammerwasser junger DBA/2J Mäuse könnten durch Störung der APZ Migration an der Nichtauslösbarkeit von ACAID beteiligt sein. Die Assoziation mit Zytoskelettkomponenten in kultivierten Trabekelwerkszellen deutet eine zusätzliche Funktion von Pdpn in der Stabilisierung der Zytoskelettarchitektur im Trabekelwerk und auch in den retinalen Müllerzellen an, ähnlich wie sie für Podozyten und Typ I Alveolar-zellen beschrieben, bzw. postuliert wurde. |
| Kurzfassung in Englisch: |
| The eye is immunologically privileged, i.e. foreign transplants reside for an extended period in the anterior chamber without being rejected. Streilein showed that the typical delayed type hypersensitivity (DTH) reaction after subcutaneous antigen injection is inhibited, if the same antigen was previously injected into the anterior chamber (AC), a phenomenon he termed “anterior chamber associated immune deviation” (ACAID). According to Streilein, ACAID is only inducible, if antigen-presenting cells (APC) leave the AC via the trabecular meshwork, where they can directly access the venous vessels, bypassing regional lymph nodes, to reach the spleen, the site where the systemic tolerance against ocular antigens is elicited.
The purpose of this thesis was to examine, how the migration of ocular APCs is directed to the outflow pathways. In other organs, this is conveyed by the lymphatic endothelium which secretes chemoattractive chemokines. As the eye lacks lymphatic vessels, it was analyzed if the tissues lining the anterior chamber take over comparable lymphatic functions in respect of APC guidance. For that, expression of the lymphatic endothelium cell (LEC) markers VEGFR3, Prox-1, Lyve-1 and Podoplanin, the chemoattractive chemokine ligands Ccl19, -20 and -21 as well as their corresponding receptors CCR6 and -7 was analyzed by PCR on trabecular meshwork and iris tissue samples. Detection of the corresponding proteins as well as their localization was demonstrated by immunofluorescence staining of sections of human and murine anterior eye segments. The chemokine contents in aqueous humor samples of young, ACAID-deficient DBA/2J mice was compared to older DBA/2J, in which ACAID was inducible, and to age-matched controls by chemokine protein array analysis.
Lyve-1 was exclusively expressed on single dendriform cells within the iris stroma, the ciliary body and the intertrabecular spaces. Within the iris Lyve-1+ cells accumulated in close proximity to capillaries. A significant part of the cells co-expressed the macrophage marker CD68. Single cells within the iris stroma also expressed Podoplanin (Pdpn), whereby most of the Pdpn+ cells were Lyve-/CD68-. A distinct labeling for Pdpn was detected at the cells of the anterior iris surface, at the cells of the trabeculum ciliare and especially on the cells of the trabecular meshwork cells. Prox-1 was only detected on the transcriptional level in trabecular meshwork and iris tissue, while VEGFR3 was neither detected by immunofluorescence staining nor by PCR analysis. The migration associated chemoattractive chemokine Ccl21 was detected at cells of the anterior iris surface, the trabecular meshwork and on cultured trabecular meshwork cells, where it showed a clear co-localization with Pdpn. The corresponding receptor CCR7 was exclusively detected on dendriform cells at the anterior iris surface, which were Lyve-1+/Pdpn-. CCR6+ cells were detected within the iris stroma nearby capillaries similar as the Lyve-1+ cells. Staining for Ccl20 was detected randomly distributed throughout the iris stroma and around Schlemms canal, including the cribriform region of the trabecular meshwork. On sections of mouse irides a strong staining at the posterior iris surface was additionally detected.
By chemokine proteinarray analysis of aqueous humor samples of young ACAID deficient DBA/2J mice, eight chemokines were found to be significantly increased, notably Ccl19 and Ccl20 among them. Aqueous humor samples of older DBA/2J mice, in which according to the literature ACAID is inducible, showed no differences compared to age-matched controls.
Analysis of the intracellular expression of Pdpn in cultured trabecular meshwork cells revealed a filament-like distribution comparable to that of components of the cytoskeleton. Double staining with cytoskeleton markers actin, tubulin and vimentin showed a clear association of Pdpn with those markers. Beside expression in the anterior eye segment, Pdpn was detected on Muller cells of the retina.
These results implicate that Pdpn can bind Ccl19, -20, -21 at the anterior iris surface as well as at the entry sites of the aqueous humor outflow tracts, and thereby regulates the migration of CCR6+ and CCR7+ dendriform cells. The more pronounced expression of Pdpn in the tissues of the conventional outflow compared to the uveoscleral outflow suggests a preference for this pathway, being consistent with Streileins’ assumptions concerning ACAID and ocular immune privilege. Changes of the chemokine levels in the aqueous humor of young DBA/2J mice might negatively interfere with the migration of APCs, which might be reflected by the ACAID deficiency. The strong association of Pdpn with the cytoskeleton in cultured trabecular meshwork cells implies a role in stabilization and maintenance of cell shape in the trabecular meshwork as well as the Muller cells of the retina, alike described for kidney podocytes and type I alveolar cells.
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