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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:bvb:29-opus-27587
URL: http://www.opus.ub.uni-erlangen.de/opus/volltexte/2011/2758/
Functional analysis of truncated APC protein in human colorectal cancers
Funktionelle Analyse von verkürztem APC Protein in humanem kolorektalen Krebs
Vijaya Chandra, Shree Harsha
| SWD-Schlagwörter: |
| Dickdarmkrebs , Dickdarmpolypose , RNS-Interferenz , Adenomatous-polyposis-coli-Protein |
| Freie Schlagwörter (Deutsch): |
| Wnt-Signalweg |
| Freie Schlagwörter (Englisch): |
| Colorectal cancers , Adenomatous Polyposis Coli , RNA Interference , APC , Wnt-Signaling |
| Fakultät: |
| Naturwissenschaftliche Fakultät |
| DDC-Sachgruppe: |
| Naturwissenschaften |
| Dokumentart: |
| Dissertation |
| Hauptberichter: |
| Behrens, Jürgen (Prof. Dr.) |
| Sprache: |
| Englisch |
| Tag der mündlichen Prüfung: |
| 28.07.2011 |
| Erstellungsjahr: |
| 2011 |
| Publikationsdatum: |
| 07.09.2011 |
| Kurzfassung in Deutsch: |
| Mutationen im APC(„Adenomatöse Polyposis Coli“)-Gen sind ein Markenzeichen beim kolorektalen Krebs (KRK). Diese sind ein frühes Ereignis während der Tumorigenese und tragen durch eine fehlgesteuerten Aktivierung des Wnt-ß-Catenin-Signalwegs zu einer unkontrollierten Proliferation der Kolonepithelzellen bei.
APC ist ein großes Protein mit zahlreichen Domänen. Als ein multifunktionelles Protein ist es an einer Vielzahl von zellulären Prozessen z.B. der Regulation der Zellproliferation, der Zelladhäsion, der Zellmigration, der Organisation des Zytoskeletts und der Stabilität von Chromsomen beteiligt. APC-Mutationen sind biallelisch, trotzdem führen diese Mutationen nicht zu einem totalen Verlust des Proteins, sondern alle kolorektalen Tumore exprimieren noch ein verkürztes N-terminales APC-Protein. Der Grund für die Erhaltung dieses N-terminalen APC-Fragmentes in den KRK ist bisher noch nicht vollständig verstanden. Das Ziel dieser Arbeit ist es, die funktionelle Relevanz dieses verkürzten APC-Proteins beim KRK herauszufinden. Mittels RNA-Interferenz wurden die verkürzten APC-Fragmente in den kolorektalen Krebszelllinien herunterreguliert. Dabei konnte ich zeigen, dass verkürztes APC essentiell für die Proliferation dieser Zelllinien in vitro ist. Tatsächlich konnte dies bei mehreren, unterschiedlichen kolorektalen Krebszelllinien demonstriert werden, welche unterschiedliche Varianten des verkürzten APCs tragen. Noch bedeutsamer ist die Tatsache, dass ich durch Xenotransplantations Experimente in Nacktmäusen nachweisen konnte, dass ein verkürztes APC für die Bildung von Tumoren durch kolorektale Tumorzellen benötigt wird.
Zusätzlich analysierte ich die Funktion einer neu identifizierten APC-Domäne mit dem Namen „ß-catenin inhibitory domain“ (CID) in verschiedenen kolorektalen Krebszellen und fand heraus, dass es eine Gegenselektion für diese Domäne in KRK gibt. Außerdem konnte ich zeigen, dass die verkürzten APC-Isoformen in KRK-Zellen immer noch die Fähigkeit besitzen, die Menge an ß-Catenin und seine transkriptionelle Aktivität negativ zu regulieren. Dieser Befund unterstützt die "just right signaling“-Hypothese, welche davon ausgeht, dass verkürzte APC-Mutationen dahingehend selektioniert werden, eine optimale Aktivität von ß-Catenin zu gewährleisten, welche der Tumorentwicklung förderlich ist.
Diese Ergebnisse verdeutlichen eine funktionelle Relevanz für die Erhaltung des verkürzten APCs in KRK und machen es zu einem Ziel einer möglichen therapeutischen Intervention. Mit dieser therapeutischen Perspektive habe ich daher shRNAs entworfen und getestet, die gegen spezifische APC-Mutationen gerichtet waren, welche in verschiedenen kolorektalen Krebszellen gefunden wurden. Tatsächlich konnte ich nachweisen, dass es möglich ist eine Allel-spezifische RNA-Interferenz gegen verkürztes APC zu erreichen.
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| Kurzfassung in Englisch: |
| Mutations of the Adenomatous Polyposis Coli (APC) gene is a hallmark of colorectal cancers (CRC). This is an early event in the process of tumorigenesis that contributes to an uncontrolled proliferation of the colonic epithelial cells by abberantly activating the Wnt-ß-catenin signaling pathway.
APC is a large protein with multiple domains and serves as a multifunctional protein involved in a variety of cellular processes such as regulation of cell proliferation, cell adhesion, cell migration, cytosketal organization and chromosomal stability. APC mutations in colorectal tumors are biallelic, however, these mutations do not lead to the complete absence of the protein. Invariably almost all of the colorectal tumors express truncated N-terminal portion of the APC protein. For what reasons the N-terminal portion of the APC protein is retained by colorectal tumors is not completely understood. This project aimed to understand the functional significance of truncated APC in colorectal cancers. Using RNA interference techniques to down-regulate truncated APC in CRC cell lines I could show that truncated APC is required for the proliferation of colorectal cancer cell lines in vitro. In fact this was demonstrated in a set of distinct CRC cell lines harbouring different kinds of truncating APC mutations. More significantly, it could be shown that truncated APC is required for tumor formation by colorectal cancer cells, as demonstrated by the Xenograft experiments in nude mice.
In addition to this, I analyzed the function of a newly identified domain of APC called the "ß-catenin inhibitory domain” (CID) in different CRC cell lines and found that there is a counter selection for this domain in colorectal cancers. Furthermore, I could show that truncated APC isoforms in CRC cells still retains the ability to negatively regulate the levels and transcriptional activity of ß-catenin. This finding is supportive of the “just right signaling” hypothesis which advocates that truncating APC mutations are selected to maintain an optimal level of ß-catenin transcriptional activity that is conducive for tumor development.
These results reveal a functional significance for the retention of truncated APC in CRC and hence project it as a possible therapeutic target. Therefore, with a therapeutic perspective, I designed and tested shRNAs to specifically target APC mutations found in different CRC cell lines. In fact it could be demonstrated that it is possible to achieve an allele-specific RNA interference targeting truncated APC.
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