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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:bvb:29-opus-32331
URL: http://www.opus.ub.uni-erlangen.de/opus/volltexte/2012/3233/
Quantitative und qualitative Analyse der Transkription CcpA-regulierter Gene
Quantitative and qualitative analysis of the transcription of CcpA-regulated genes
Steinert, Nadine
| SWD-Schlagwörter: |
| Systembiologie , Heubacillus , Genregulation , Real time quantitative PCR |
| Freie Schlagwörter (Deutsch): |
| Bacillus subtilis , Kohlenstoffkatabolitenregulation , quantitative real-time PCR , Systembiologie , intrazelluläre mRNA-Konzentration |
| Freie Schlagwörter (Englisch): |
| Bacillus subtilis , carbon catabolite regulation , quantitative real-time PCR , systems biology , intracellular transcript concentration |
| Fakultät: |
| Naturwissenschaftliche Fakultät |
| DDC-Sachgruppe: |
| Biowissenschaften, Biologie |
| Dokumentart: |
| Dissertation |
| Hauptberichter: |
| Burkovski, Andreas (Prof. Dr.) |
| Sprache: |
| Deutsch |
| Tag der mündlichen Prüfung: |
| 27.03.2012 |
| Erstellungsjahr: |
| 2011 |
| Publikationsdatum: |
| 27.04.2012 |
| Kurzfassung in Deutsch: |
| Der zentrale Regulator der Kohlenstoffkatabolitenregulation (KKR), das Katabolitkontrollprotein A (CcpA), reguliert etwa 10 % aller Gene in B. subtilis, welche neben dem Kohlenstoffmetabolismus auch in den Überflussstoffwechsel, den Stickstoff- und Phosphatmetabolismus sowie die Aminosäuresynthese involviert sind (Fujita, 2009). Um ein quantitatives Verständnis dieses weitreichenden Regulationsnetzwerks zu entwickeln, soll im Rahmen des Systembiologie-Projekts BaCell-SysMO bereits determinierte kinetische Daten der Protein-Komponenten der KKR mit der Transkriptbildungsrate in Abhängigkeit der CcpA-vermittelten Regulation vernetzt werden. Dafür wurde im ersten Schritt eine Methode für die absolute Quantifizierung der intrazellulären Transkriptkonzentration auf Basis der quantitativen real-time PCR entwickelt. Diese ermöglicht die akkurate mRNA-Quantifizierung beim Übergang zu physiologischem Stress. Die Validierung der Methodik erfolgte quantitativ mittels β-Galaktosidase-Aktivitätsmessungen und qualitativ mittels RNA-Hybridisierungs-experimenten. Anschließend erfolgte die Optimierung der Wachstumsbedingungen von B. subtilis in Minimalmedium ohne Aminosäurezugabe auf die maximale Wuchsrate. Unter diesen Kultivierungsbedingungen wurden mittels zeitaufgelöster Quantifizierung der Transkriptkonzentration die Rate der Akkumulierung (Summe aus Transkriptauf- und abbau) und des Abbaus der CcpA-regulierten Gene xylA und xynP ermittelt. Daraus berechnete sich die Transkriptbildungsrate, welche als Kenngröße für die Reaktion der Zelle auf die (De-)Aktivierung der KKR definiert ist.
Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde die alsS-Expression in KKR-defizienten B. subtilis-Mutanten in Abhängigkeit der Kohlenstoffquelle analysiert. Anschließend wurde erörtert, über welche Wege die CcpA-abhängige Aktivierung der Expression des alsSD-Operons funktionieren könnte.
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| Kurzfassung in Englisch: |
| The central regulator of carbon catabolite regulation (CCR), the catabolite control protein A (CcpA), regulates about 10 % of the whole genome in B. subtilis. These genes are involved in carbon metabolism, overflow metabolism, amino acid synthesis, nitrogen and phosphate metabolism (Fujita, 2009). To develop a quantitative understanding of this extensive regulatory network, available kinetic data of protein components of the CCR will be cross-linked with transcription rates of CcpA-depending regulation within the systems biology project BaCell-SysMO. Therefor, at first a real-time PCR-based method for the absolute quantification of intracellular transcript concentrations was developed. This allowed the accurate quantification of mRNA during the transition to physiological stress situations. The method was validated quantitatively via β-galactosidase activity measurements and qualitatively via RNA hybridization experiments. Then the growth conditions of B. subtilis in minimal medium without addition of amino acids were optimized to get a maximal growth rate. Using time-resolved quantification of the intracellular transcript concentration, the rate of mRNA accumulation (sum of transcript formation and decay) and the rate of mRNA decay of CcpA-regulated genes xylA and xynP were determined. Using these data the transcript formation rate was calculated, which is defined as parameter for the response to activation or deactivation of CCR in the bacterial cell.
In the second part of this thesis the expression of alsS in CCR-deficient B. subtilis strains depending on the present carbon source was analysed. Further it is discussed which mechanism leads to the CcpA-dependent activation of the expression of the alsSD operon.
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