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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:bvb:29-opus-33655
URL: http://www.opus.ub.uni-erlangen.de/opus/volltexte/2012/3365/
A novel chip-based parallel transfection approach to evaluate paracrine cell interactions
Ein neues Chip-basiertes paralleles Transfektionsverfahren für die Analyse parakriner Zellinteraktionen
Kuhn, Elisabeth
| SWD-Schlagwörter: |
| Systembiologie , Zellkontakt , Zellkommunikation |
| Freie Schlagwörter (Deutsch): |
| Reverse Transfektion, Zellchip-Analyse, differentielle Transfektion, Diffusionseingrenzung, parakrin |
| Freie Schlagwörter (Englisch): |
| Reverse Transfection, cell chip analysis, differential transfection, restriction of diffusion, paracrine |
| Fakultät: |
| Naturwissenschaftliche Fakultät |
| DDC-Sachgruppe: |
| Biowissenschaften, Biologie |
| Dokumentart: |
| Dissertation |
| Hauptberichter: |
| Stürzl, Michael (Prof. Dr. Dr.) |
| Sprache: |
| Englisch |
| Tag der mündlichen Prüfung: |
| 22.06.2012 |
| Erstellungsjahr: |
| 2012 |
| Publikationsdatum: |
| 04.07.2012 |
| Kurzfassung in Englisch: |
| Chip-based cell biological tests are of increasing importance in the high-throughput analysis of gene functions. The cell chip technology creates microarrays of cell clusters that have been simultaneously transfected with different plasmids within a lawn of untransfected cells. The automation of experimental processes and miniaturization of assay allow the performance of several hundred transfection experiments on a single slide which significantly increases the speed of gene function analysis. However, all available cell chip-based approaches are only susceptible to the analysis of autocrine gene function. This limits the power of this method since most genes have also an impact on juxta- and paracrine cell communications which are of high relevance for many physiologic and pathologic processes.
Here, we developed a novel and robust method for the highly parallel analysis of paracrine and juxtacrine cell interaction. To that goal, the cell chip technology was adapted to be per-formed with two different cell types: a producer cell which is transfected with the effector gene and subsequently secrets a paracrine mediator (effector cell), and a responder cell which is not transfected but responds to the secreted paracrine mediator (indicator cell). Spot-to-spot diffusion was prevented by a matrix overlay, ultimately allowing 192 simultaneous transfec-tion experiments for screening of paracrine gene activity to be performed on the same chip. Subsequently, we demonstrate the broad applicability and robustness of this method using (1) various indicator cell types, (2) various paracrine inducers, and (3) various indicator genes, all of which are of relevance for angiogenesis, wound healing, and cancer research.
The herein described approach allows for the first time a highly parallel analysis of gene func-tions in paracrine cell interactions at the cell chip level. Due to its robustness and broad applicability in a wide range of research areas, this method holds promise to facilitate and speed up the characterisation of genes involved in heterotypic cell interactions.
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| Kurzfassung in Deutsch: |
| Chip-basierte zellbiologische Verfahren werden für die Hochdurchsatzanalyse von Genfunktionen immer wichtiger. Mit dem Zellchipverfahren wird ein Microarray bestehend aus Zellklustern, die zeitgleich mit unterschiedlichen Plasmiden transfiziert werden, hergestellt. Durch Automatisierung und Miniaturisierung des Testverfahrens können mehrere hundert Transfektionsexperimente auf einem Chip durchgeführt werden, wodurch sich die Geschwin-digkeit von Genfunktionsanalysen signifikant erhöht. Allerdings sind die derzeit verfügbaren Zellchipverfahren nur für die Untersuchung autokriner Genfunktionen geeignet. Diese Ein-schränkung stellt eine wesentliche Schwäche der bisherigen Zellchiptechniken dar, da auch juxta- und parakrine Zellkommunikation eine wichtige Rolle in vielen physiologischen und pathologischen Prozessen spielen.
In dieser Arbeit wurde eine neue und robuste Methode zur Untersuchung parakriner und jux-takriner Zellkommunikation im Hochdurchsatzformat entwickelt. Hierfür wurde die Zellchip-technik derart erweitert, dass anstelle von nur einer Zellart zwei unterschiedliche Zellarten eingesetzt werden: eine Effektorzelle, welche transfiziert wird und daraufhin einen parakrinen Mediator freisetzt, und eine Indikatorzelle, welche nicht transfiziert, aber durch den von der Effektorzelle freigesetzten parakrinen Mediator induziert wird. Durch Überschichten mit einer Matrix konnte die Diffusion löslicher Mediatoren auf den jeweiligen Transfektionsbereich begrenzt werden. Dies erlaubte 192 parallele Transfektionsexperimente zur Untersuchung pa-rakriner Geneffekte auf einem Zellchip durchzuführen. Die breite Anwendbarkeit und Robustheit dieser neuen Methode wurde anschließend mittels (1) unterschiedlichen Indikator-zelltypen, (2) unterschiedlichen parakrinen Mediatoren, und (3) unterschiedlichen Indikator-genen aufgezeigt.
Die in dieser Arbeit beschriebene Technik ermöglicht zum ersten Mal die Analyse von Gen-funktionen bei parakriner Zellkommunikation auf der Zellchipebene. Diese Methode ist in unterschiedlichen Forschungsgebieten anwendbar und könnte somit die Charakterisierung bestimmter Gene bei der Kommunikation zwischen zwei unterschiedlichen Zelltypen erheblich vereinfachen und beschleunigen.
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