Hinweis zum Urheberrecht
Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:bvb:29-opus-35662
URL: http://www.opus.ub.uni-erlangen.de/opus/volltexte/2012/3566/
Funktionelle Charakterisierung des Typ III-Effektors XopJ aus Xanthomonas campestris pv. vesicatoria
Functional Characterisation of the Xanthomonas campestris pv. vesicatoria Type III Effector XopJ
Bartetzko, Verena
| SWD-Schlagwörter: |
| Xanthomonas campestris vesicatoria , Proteasom , Phytopathologie , Myristoylierung , Proteintransport |
| Freie Schlagwörter (Deutsch): |
| Typ III-Effektor, Bakterielle Fleckenkrankheit, XopJ, RPT6 |
| Freie Schlagwörter (Englisch): |
| Type III effector, bacterial spot disease, XopJ, RPT6 |
| Fakultät: |
| Naturwissenschaftliche Fakultät |
| DDC-Sachgruppe: |
| Biowissenschaften, Biologie |
| Dokumentart: |
| Dissertation |
| Hauptberichter: |
| Börnke, Frederik (PD Dr. rer. nat.) |
| Sprache: |
| Deutsch |
| Tag der mündlichen Prüfung: |
| 28.09.2012 |
| Erstellungsjahr: |
| 2012 |
| Publikationsdatum: |
| 11.10.2012 |
| Kurzfassung in Deutsch: |
| Xanthomonas campestris pv. vesicatoria (Xcv) ist der Erreger der bakteriellen Fleckenkrankheit in Tomaten (Solanum lycopersicum) und Paprika (Capsicum annuum). Bei Xanthomonas handelt es sich um ein biotrophes Pathogen, das auf lebende Wirtszellen angewiesen ist. Die Krankheit äußert sich in Blättern durch wassergefüllte Läsionen und Hypertrophie der Mesophyllzellen. Während der Besiedlung einer Pflanze injiziert Xanthomonas campestris pv. vesicatoria mehr als 30 Effektorproteine über das Typ III-Sekretionssystem in das Zytosol der Pflanzenzelle. Dort können Effektoren die Krankheit fördern, indem sie einerseits den Stoffwechsel des Wirtes zu ihren Gunsten umlenken und andererseits indem sie die Abwehrantworten des Wirtes inhibieren. Hierbei spricht man von einer kompatiblen Interaktion. Allerdings können Pflanzen auch einige Effektoren durch spezialisierte Resistenzproteine erkennen und zur Eindämmung des Bakterien- wachstums eine hypersensitive Reaktion (HR), gefolgt von lokalem Zelltod, induzieren. Hierbei handelt es sich um die Effektor-vermittelte Immunität (ETI: effector triggered immunity) und eine inkompatible Interaktion.
Im Rahmen dieser Arbeit konnte das Effektorprotein XopJ aus Xanthomonas campestris pv. vesicatoria funktionell weiter charakterisiert werden. Bei XopJ handelt es sich um einen Typ III-Effektor der YopJ-Familie, die sowohl in tier- als auch in pflanzenpathogenen Bakterien verbreitet ist. Transiente Expression eines XopJ-GFP-Fusionsproteins zeigte eine Lokalisierung des Effektors an der Plasmamembran der Pflanzenzelle. Mutationsanalysen legten weiterhin nahe, dass diese Lokalisierung durch eine Myristoylierung und wahrscheinlich auch durch eine Palmitoylierung am N-Terminus des Proteins vermittelt wird. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass XopJ die Sekretion eines GFP-Reporterproteins (secGFP) in den Apoplasten hemmt und darüber hinaus die durch PAMPs (pathogen-associated molecular pattern) ausgelöste Ablagerung von Kallose an der Zellwand unterdrückt. Diese Ergebnisse deuteten darauf hin, dass XopJ Teile der Zellwand-assoziierten basalen Abwehr in Pflanzen unterdrücken kann. Diese Virulenzfunktionen waren sowohl von einer intakten katalytischen Triade des Effektors, als auch von einem funktionalen Myristoylierungssignal abhängig. Unter Einsatz des Hefe-Zwei-Hybrid-Systems wurde RPT6 als ein möglicher Interaktionspartner von XopJ in Pflanzen identifiziert. Die Interaktion zwischen XopJ und RPT6 konnte auch in planta sowohl durch Koimmunpräzipitations- als auch durch Bimolekulare Fluoreszenzkomplementationsexperimente bestätigt werden. RPT6 ist Bestandteil der regulatorischen 19 S-Untereinheit des 26 S-Proteasoms in Eukaryoten.
Die Messung der Proteasomaktivität in transient XopJ-exprimierenden Blättern zeigte, dass die Interaktion des Effektors mit RPT6 zu einer Hemmung der Proteasomaktivität und zur Akkumulation ubiquitinierter Proteine in der Pflanzenzelle führt. Dieser Effekt war wiederum abhängig von einer intakten katalytischen Triade und der Myristoylierung des Effektors. Durch Verwendung einer Xcv xopJ-Verlustmutante konnte gezeigt werden, dass XopJ wahrscheinlich für die Reduzierung der Proteasomaktivität während einer kompatiblen Interaktion mit Paprika verantwortlich ist. Diese Daten deuteten darauf hin, dass XopJ möglicherweise durch Verminderung der Proteasomaktivität Abwehrreaktionen der Pflanze unterdrückt und impliziert eine Rolle des Proteasoms in der basalen Abwehr von Pflanzen.
Um die Wirkungsweise von XopJ biochemisch zu untersuchen, wurde in E. coli exprimiertes XopJ auf eine mögliche Acetyltransferaseaktivität hin getestet. Allerdings konnten diese Experimente eine enzymatische Aktivität von XopJ bisher nicht belegen, obwohl die Mutation eines in den möglichen katalytischen Mechanismus involvierten Lysinrestes im XopJ-Polypeptid die Interaktion mit RPT6 und auch den Hemmeffekt auf das Proteasom unterbindet. Insofern bleibt die biochemische Funktion von XopJ im Moment noch unklar.
Die Behandlung von XopJ-exprimierenden Blättern von Nicotiana benthamiana mit Salicylsäure (SA) führte zur Auslösung einer HR. Herunterregulierung von Komponenten der R-Protein-vermittelten Reaktion mittels Virus-induzierter Gen-Stilllegung (VIGS) legen die Beteiligung eines R-Proteins an der Auslösung der HR nahe. Außerdem wurde die Rolle einiger Komponenten des SA-Signaltransduktionsweges bei der Auslösung der HR nach XopJ-Expression untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, dass die HR unabhängig von NPR1, RAR1 und EDS1 war. In EDS1-herunterregulierten Pflanzen wurde eine HR auch in Abwesenheit von SA ausgelöst. |
| Kurzfassung in Englisch: |
| Xanthomonas campestris pv. vesicatoria (Xcv) is the causative agent of bacterial spot disease in tomato (Lycopersicum esculentum) and pepper (Capsicum annuum). Xanthomonas is a biotrophic pathogen and therefore it depends on living host cells. Water-soaked lesions and hypertrophy of mesophyll cells are the characteristics of this disease. During infection Xcv injects, via its type III secretion system, more than 30 effector proteins into the cytosol of plant cells. Once inside the cell, effectors can promote infection by redirecting the host’s metabolism to their own favour and by inhibiting the immune responses. This is called a compatible interaction. However, plants are able to recognize some effectors via specialised resistance proteins that leads to hypersensitive response (HR) and thus to the induction of a local cell death – consequently restricting bacterial growth. This effector-triggered immunity (ETI) is called an incompatible interaction.
In this work, the effector protein XopJ from Xanthomonas campestris pv. vesicatoria could be further functionally characterised. XopJ is a type III effector of the YopJ family. This family is prevalent in animal as well as in plant pathogenic bacteria. Transient expression of XopJ-GFP fusions showed a localisation of the effector at the plasma membrane of plant cells. Mutational analyses indicated that the localisation is mediated by myristoylation and, most likely, by palmitoylation at the N terminus of the protein. Furthermore, it could be shown that XopJ inhibits the secretion of a GFP reporter protein (secGFP) to the apoplast. In addition to that, the XopJ effector also suppressed PAMP (pathogen-associated molecular pattern)-induced deposition of callose at the cell wall. These results suggested that XopJ can prevent cell wall-associated basal defence in plants. These virulence functions were dependent on an intact catalytic triad and on a functional myristoylation motif. Using the yeast-two hybrid system, RPT6 was identified as a putative interaction partner of XopJ in plants. This interaction could also be confirmed in planta by co-immunoprecipitations and bimolecular fluorescence complementation experiments. RPT6 is a component of the 19 S subunit of the 26 S proteasome in eukaryotes.
Measurement of the proteasome activity in leaves that transiently expressed XopJ showed that the interaction between effector and RPT6 leads to an inhibition of the proteasome activity and accumulation of ubiquitinated proteins in plant cells. Again, this effect was dependent on the intact catalytic triad and the myristoylation of the effector. By using a Xcv xopJ deletion mutant, it was shown that XopJ is probably responsible for the attenuation of proteasome activity during compatible interaction with pepper. These data indicate that XopJ possibly suppresses the plant’s defence reactions by reduction of the proteasomal activity, implicating that the proteasome becomes important during basal defence of plants.
In order to biochemically investigate the mode of action of XopJ, the effector was expressed in E. coli and tested for possible acetyltransferase activity. Although the mutation of a lysine residue, located in the XopJ polypeptide and possibly involved in a catalytic mechanism, eliminates the interaction of the effector with RPT6 and suppresses the inhibition of the proteasome activity, these experiments could not substantiate an enzymatic activity of XopJ. Thus, the biochemical activity still remains obscure.
The treatment of XopJ-expressing Nicotiana benthamiana leaves with salicylic acid (SA) triggered a HR. Silencing components of the R protein-mediated reaction via virus induced gene silencing (VIGS) suggested that a R protein is involved in the HR activation. In addition, the role of some components of SA signalling were analysed in the activation of the HR subsequent to XopJ expression thereby showing the independence between HR and NPR1, RAR1, and EDS1. Even in the absence of SA, the HR was triggered in EDS1-silenced plants. |
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