Hinweis zum Urheberrecht
Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:bvb:29-opus-2638
URL: http://www.opus.ub.uni-erlangen.de/opus/volltexte/2005/263/
Versuche zur affinitätschromatographischen Reinigung, zur Expression und zur funktionellen Charakterisierung der mitochondriellen Acetyl-CoA Karboxylase Hfa1 in Hefe
Experiments on affinity chromatography purification, expression and functional characterization of the mitochondrial acetyl-CoA carboxylase Hfa1 in yeast
Marthol, Sandra
| SWD-Schlagwörter: |
| Acetyl-CoA-Carboxylase , Mitochondrium , Liponsäure <alpha-> , Atmung |
| Freie Schlagwörter (Englisch): |
| acetyl-CoA-carboxylase , mitochondrion , lipoic acid , respiration |
| Fakultät: |
| Naturwissenschaftliche Fakultät |
| Fakultät: |
| Naturwissenschaftliche Fakultät |
| DDC-Sachgruppe: |
| Biowissenschaften, Biologie |
| Dokumentart: |
| Dissertation |
| Hauptberichter: |
| Schweizer, Eckhart (Prof.Dr.) |
| Sprache: |
| Deutsch |
| Tag der mündlichen Prüfung: |
| 10.08.2005 |
| Erstellungsjahr: |
| 2005 |
| Publikationsdatum: |
| 21.11.2005 |
| Kurzfassung in Deutsch: |
| Ziel der vorliegenden Arbeit war, die vermutete Funktion des HFA1-Genproduktes in Hefe als eine mitochondriale Acetyl-CoA Karboxylase experimentell nachzuweisen. Weiterhin wurden Hinweise auf einen ungewöhnlichen Translations-Startpunkt des HFA1-Leserahmens erhärtet und der genaue Initiationsort näher eingegrenzt. Im Einzelnen wurden folgende Ergebnisse erzielt:
1. Es wurden Versuche zur affinitätschromatographischen Reinigung von Hexahistidin-markiertem, intaktem Hfa1p mittels Ni2+-Chelatchromatographie durchgeführt. Das Protein erwies sich als fest mit der zellulären Membranfraktion assoziiert und konnte weder durch Detergenzien wie CHAPS oder Triton-X-100 noch durch Guanidinhydrochlorid solubilisiert werden. Spuren affinitätschromatographisch gereinigten Hfa1p gingen beim Konzentrieren der verdünnten Lösungen verloren.
2. Es wurde versucht, verschiedene C-terminal verkürzte, Hexahistidin-markierte Teilbereiche von HFA1 zu exprimieren und anschließend über Ni2+-Chelatchromatographie zu reinigen. Es gelang in keinem Fall, die Expression dieser Fragmente unter der Kontrolle ihres eigenen oder unter der eines Fremdpromotors (ADH1) im homologen Hefesystem nachzuweisen.
3. Es wurde versucht, sowohl intaktes als auch C-terminal geringfügig verkürztes Hfa1p mittels Affinitätschromatographie an monomerer Avidin-Sepharose zu reinigen. Die gereinigten Biotin-Proteine wurden durch SDS-PAGE aufgetrennt und das vermutete Gemisch der beiden gleichgroßen Proteine Hfa1p und Acc1p N-terminal ansequenziert. Neben der Acc1p-Sequenz konnte eine Hfa1p-spezifische Sequenz weder erkannt noch hergeleitet werden.
4. Als drittes affinitätschromatographisches Verfahren wurde die Auftrennung eines Hfa1p-ProteinA Fusionskonstruktes an IgG-Sepharose untersucht. Eine Reinigung des Fusionsproteins verlief hier zwar grundsätzlich positiv, jedoch waren die erzielten Ausbeuten auf Grund der schlechten Bindung an die Matrix und auf Grund der Unmöglichkeit, die verdünnten Säuleneluate verlustfrei zu konzentrieren, für eine anschließende Analyse des Proteins zu gering.
5. Das Hfa1-ProteinA Fusionsprotein erwies sich im Funktionstest bei der genetischen Komplementation einer hfa1-Nullmutante als funktionsfähig, wenn dafür gesorgt wurde, dass die transformierten Mutantenzellen keine rho-negativen Mitochondrien enthielten. Bei diesen Versuchen wurde eine bei der Fusion entstandene Punktmutation im HFA1-Gen erkannt und eliminiert.
6. Die Acetyl-CoA Karboxylase (ACC) Aktivität von Hfa1p wurde mit drei verschiedenen experimentellen Ansätzen nachgewiesen: zum einen wurden die unterschiedlichen ACC-Aktivitäten im Rohextrakt von Wildtyp, hfa1, acc1 und acc1/hfa1-Stämmen bestimmt und die gemessenen Unterschiede mit der Anwesenheit bzw. dem Fehlen von Acc1p bzw. Hfa1p korreliert. Zum anderen wurde ein HFA1-Konstrukt hergestellt, in dem die Promotor- und die vermutete mitochondrielle Import-Sequenz von Hfa1p durch den ACC1-Promotor und die ersten 5. Aminosäuren von Acc1p ersetzt worden waren. Mit diesem Konstrukt konnte ein cytoplasmatischer acc1-Defekt komplementiert werden. Enzymchemische Messungen zeigten schließlich, dass die im Zellextrakt der acc1-Mutante fehlende ACC-Aktivität in der entsprechenden HFA1-Transformante wieder zu Wildtyp-Niveau restituiert war. Ein ohne mitochondrielle Importsequenz exprimiertes Hfa1-Protein besaß somit cytoplasmatische Acetyl-CoA Karboxylase-Aktivität.
7. Der Nachweis einer mitochondriellen Lokalisation der HFA1-kodierten Acetyl-CoA Karboxylase gelang mit Hilfe einer HFA1-GFP Reporterfusion. Die damit erzeugte in situ Fluoreszenz von Tranformanten-Zellen war auf dieselben intrazellulären Kompartimente beschränkt, die auch durch den Mitochondrien-spezifischen Fluoreszenz-Marker DsRed angefärbt wurden.
8. Das erste ATG-Triplett des HFA1-Leserahmens wurde als Startstelle der Hfa1p-Translation ausgeschlossen, nachdem ein bis auf diese Position verkürztes HFA1-Konstrukt den Phänotyp einer hfa1-Nullmutante nicht zu komplementieren vermochte.
9. Zum Nachweis einer ungewöhnlichen Translations-Initiation von HFA1 wurden N-terminal verkürzte Derivate der ATG-freien Präsequenz des HFA1-Leserahmens mit dem GFP-Gen fusioniert. Die HFA1-Bereiche waren so gewählt, dass die Translation des Konstrukts entweder nur über ein alternatives Startcodon oder über ein um +1 bzw. -1 verschobenes Leseraster und ein darin enthaltenes ATG-Codon stattfinden konnte. Nach Transformation der verkürzten Konstrukte in Hefe konnte in allen Transformanten eine, zumeist Organellen-lokalisierte, grüne Fluoreszenz nachgewiesen werden. Die Befunde sprachen für eine Translations-Initiation der HFA1-mRNA durch ein alternatives Startcodon innerhalb der AUG-freien „leader“-Sequenz und nicht für einen Translationsstart mittels ribosomaler Leserasterverschiebung.
10. Durch genetische Komplementationsversuche mit N-terminal verkürzten HFA1-Konstrukten wurde der funktionell unentbehrliche Teil der HFA1-Anfangssequenz eingegrenzt. Konstrukte, die vor dem ersten ATG-Codon noch 450, 230 bzw. 205 Nukleotide enthielten, zeigten unter der Kontrolle eines ATG-freien ADH-Promotors positive Komplementation einer hfa1-Mutation. Eine Verkürzung mit nur noch 150 Nukleotiden vor dem ersten ATG war Komplementations-negativ. Der Hfa1-Translationsstart wird daher im Bereich zwischen -150 und -205 Nukleotide vor dem ersten ATG-Triplett des HFA1-Leserahmens angenommen. Als Startcodon käme in diesem Bereich evtl. ein AGG-Triplett in Frage, dessen Initiationskompetenz aus in vitro Versuchen anderer Autoren bekannt ist. |
| Kurzfassung in Englisch: |
| The aim of the present study was to confirm the HFA1 gene product of yeast to function as a mitochondrial acetyl-CoA carboxylase. In addition, the suspected unusual translational initiation site of the HFA1 reading frame was further corroborated and its position was narrowed down to a distinct nucleotide sequence in the HFA1 coding region. In detail, the following results were obtained:
1. Purification of hexahistidine-tagged, intact Hfa1p was intended by Ni2+-affinity chromatography. However, the protein proved to be strongly associated with the cellular membrane and was neither solubilized by detergents such as CHAPS or Triton-X-100 nor by guanidinium hydrochloride. Traces of affinity-purified Hfa1p which were nevertheless obtained were lost in the final concentration process.
2. Attempts were made to express several C-terminally truncated, hexahistidine-tagged fragments of HFA1 and to subsequently purify them by Ni2+-affinity chromatography. In no case, successful expression of any of these fragments was demonstrated, independent of whether they were expressed from their own or from a heterologous yeast promoter (ADH1).
3. Attempts were made to purify both intact and C-terminally truncated Hfa1p by affinity chromatography on monomeric avidin sepharose. The purified biotin proteins were separated by SDS-PAGE and the putative mixture of the two equally-sized proteins, Hfa1p and Acc1p, was N-terminally sequenced. Only Acc1p, but no Hfa1p-specific sequence could be identified in this sample.
4. In another experimental approach, affinity chromatography of an HFA1p-proteinA fusion on IgG-sepharose was examined. Principally, purification of the fusion protein proved to be successful. However, the protein yield was too low to allow subsequent analysis of the protein. Obviously, only a minor portion of the fusion protein present in the cell extract was bound to the affinity matrix. Again, the affinity-purified protein was lost upon concentration.
5. The Hfa1-proteinA fusion protein proved to be functional and complemented a hfa1-mutant. As a prerequisite for this complementation, the secondary loss of mitochondrial DNA in the respiratory-defective hfa1-mutant had to be prevented.
6. Acetyl-CoA carboxylase (ACC) activity of Hfa1p was demonstrated by three different experimental approaches: first, the ACC-activities in cell extracts from wild type, hfa1, acc1 and acc1/hfa1-strains were measured and the differences were correlated with the presence or absence of Acc1p or Hfa1p in the respective strain. On the other hand, a HFA1-construct was created in which the promoter- and the putative mitochondrial targeting-sequence of Hfa1p were replaced by the ACC1-promoter including the first five amino acids of Acc1p. This construct was capable of complementing a cytoplasmic acc1-defect. Enzyme activity measurements finally showed that the lack of ACC-activity in the acc1-mutant was restored to wild type levels upon transformation with the respective HFA1-construct. Thus, the Hfa1-protein lacking its mitochondrial targeting sequence obviously exhibits cytoplasmic acetyl-CoA carboxylase activity.
7. Mitochondrial localization of HFA1-encoded acetyl-CoA carboxylase was demonstrated using a HFA1-GFP reporter construct. In vivo fluorescence of HFA1-GFP transformed yeast cells was associated with the same cellular compartments that were stained by the mitochondrium-specific fluorescence-marker DsRed.
8. The first ATG-triplett of the HFA1 reading frame was excluded to function as translational start site of Hfa1p, because a construct lacking the DNA sequence upstream of this site was unable to complement a hfa1-null mutant.
9. To examine the unusual translational initiation of HFA1 in more detail, several N-terminally truncated derivatives of the ATG-free HFA1-presequence were fused with the GFP-gene. For this experiment, the various HFA1-fragments were chosen in a way, that translation of the HFA1 coding sequence was only possible by the use of either an alternative start codon or a +1 or-1 ribosomal frameshifting event. Expression of the constructs in yeast revealed in all cases essentially the same green fluorescence, being mostly located in the organellar cell compartment. These results strongly suggested the translational initiation of HFA1-mRNA by an alternative start codon within the AUG-free leader rather than the translational start by ribosomal frameshifting.
10. The functionally essential part of the HFA1-leader sequence was delimited by genetic complementation experiments using N-terminally truncated HFA1-constructs. Constructs containing 450, 230 or 205 nucleotides upstream of the first ATG-codon complemented the hfa1-mutation when they were expressed under the control of an ATG-free ADH-promoter. In contrast, a truncated HFA1-version containing only 150 nucleotides in front of the first ATG-codon was complementation-negative. The translational initiation site is therefore considered to be located between nucleotides -150 and -205 upstream of the first ATG-triplett of the HFA1-reading frame. The AGG-codon at position -189 is considered as a possible candidate for translational initiation. The competence of this triplett for initiating translation in a yeast in vitro system has been demonstrated by other authors. |
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