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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:bvb:29-opus-26486
URL: http://www.opus.ub.uni-erlangen.de/opus/volltexte/2011/2648/
Global and Targeted Proteomic Strategies for Biomarker Discovery: Technology Comparison and Assay Development for the Identification of Putative Ovarian Cancer Biomarkers
Globale und Targeted Proteomicsmethoden zur Identifizierung von Biomarkern: Vergleich verschiedener Plattformen und Entwicklung von Methoden zur Identifizierung potentieller Biomarker für Ovarialkrebs
Elschenbroich, Sarah
| SWD-Schlagwörter: |
| Biomarker |
| Freie Schlagwörter (Deutsch): |
| Ovarialkrebs , Proteomics , SRM-MS |
| Freie Schlagwörter (Englisch): |
| Ovarian Cancer , Proteomics, Biomarker , SRM-MS |
| Fakultät: |
| Naturwissenschaftliche Fakultät |
| DDC-Sachgruppe: |
| Naturwissenschaften |
| Dokumentart: |
| Dissertation |
| Hauptberichter: |
| Pischetsrieder, Monika (Prof. Dr.) |
| Sprache: |
| Englisch |
| Tag der mündlichen Prüfung: |
| 26.05.2011 |
| Erstellungsjahr: |
| 2011 |
| Publikationsdatum: |
| 28.06.2011 |
| Kurzfassung in Englisch: |
| A molecular biomarker is a measurable indicator for biological or pathogenic processes, e.g. a metabolite, DNA methylation or a protein. The promise of clinical proteomics is to discover and validate such protein biomarkers by virtue of MS-based technologies. Recently, communal efforts are undertaken to streamline this process by application of new technological platforms in a strategic manner. A so-called “MS-based biomarker discovery pipeline” has been proposed, in which putative biomarkers are first discovered from clinically relevant patients’ samples in global proteomics experiments. Subsequently, promising candidates are verified in a multiplexed fashion using targeted quantification methods (i.e. selected reaction monitoring-MS; SRM-MS) in independent sample sets. The few candidates successful in this initial verification might then proceed to more thorough validation by well-established methods (e.g. ELISA) in large patient cohorts.
The aim of this thesis was two-fold: First, experiments with different sample types were designed to deliver the first direct comparison between two state-of-the-art proteomics platforms, thus further evaluating their capabilities for use in clinical proteomics. Samples originating from a highly complex HEK whole cell lysate, a membrane-enriched fraction from murine C2C12 skeletal muscle cells, and a proximal tissue fluid (ascitic fluid) were subjected to replicate analysis by OFFGEL (12 fractions, pH 3 – 10) followed by RP-LC-MS/MS or 12-step on-line Multidimensional Protein Identification Technology (MudPIT) to allow for a comprehensive performance evaluation.
These experiments showed that OFFGEL achieves superior peptide focussing as compared to MudPIT: Depending on the sample, 76 – 88 % of peptides were binned into one fraction, whereas with MudPIT, only 36 – 61 % of peptides were detected in only one step of the analysis. However, both platforms performed equally in regards to the numbers of identified peptides and proteins for the membrane-enriched C2C12 samples (1428 proteins identified with MudPIT, 1398 with OFFGEL-LC-MS/MS) and ascitic fluid samples (346 proteins identified with MudPIT, 461 with OFFGEL-LC-MS/MS). Interestingly, for the highly complex HEK samples, better peptide focussing by OFFGEL-LC-MS/MS apparently resulted in a higher number of identified proteins (3143 vs. 2242 with MudPIT). Experiments with the membrane-enriched C2C12 samples demonstrated equal performance of both techniques for the analysis of highly hydrophobic transmembrane proteins. In summary, it was concluded that the choice of method is dependent on the requirements of the project: The highly automated MudPIT might be advisable for routine proteome analyses, possibly in limited sample volumes. The more cost- and labour-intensive OFFGEL fractionation, on the other hand, might be a valuable alternative for studies demanding a high degree of peptide separation.
The second aim of the thesis was a proof-of-concept application of a MS-based biomarker discovery pipeline to identify putative biomarker proteins for serous ovarian cancer, a malignancy for which reliable biomarkers are scarce.
Ascitic fluid samples from patients with serous-type epithelial ovarian cancer were analyzed using both OFFGEL-LC-MS/MS and MudPIT. These experiments yielded a comprehensive description of the ascitic fluid proteome with more than 500 protein identifications, which can serve as a valuable resource for future ovarian cancer research. Additionally, a semi-quantitative comparison using MudPIT and assessing relative protein abundances by Spectral Counting between ascitic fluid samples from ovarian cancer patients and from women with benign tumours of the ovary revealed 43 proteins, which were of higher abundance in the cancerous sample group. Integration of this data with published transcriptomic and proteomic datasets led to a panel of 51 biomarker candidate proteins. Systematic SRM-MS assay development was performed for a subset of thirteen of these candidates using synthetic peptides. Preliminary SRM-MS measurements in ascitic fluid samples guided the selection of four candidates for precise quantification by stable isotope dilution-SRM-MS (SID-SRM-MS) in independent ascitic fluid (n=10) and serum samples (n=20). These experiments showed small (~2x) but significant elevations of the concentration of the three candidate proteins MSLN, GAPDH, and PKM1/2 in both ascitic fluid and serum samples of cancer patients as compared to control groups. The results demonstrate that the applied pipeline workflow can serve as a template for the proteomics-based discovery of cancer biomarkers and deliver further evidence for the implication of short-listed biomarker candidates in ovarian cancer biology. |
| Kurzfassung in Deutsch: |
| Ein molekularer Biomarker ist ein messbarer Indikator eines bio- oder pathologischen Prozesses, z.B. ein Metabolit, DNS-Methylierungen oder ein Protein. Ein Ziel der klinischen Proteomforschung ist es, Proteinbiomarker mit Hilfe MS-basierter Techniken zu identifizieren sowie zu validieren. In jüngster Zeit gehen die Bemühungen in Richtung einer Rationalisierung des gesamten Prozesses, wobei leistungsfähige analytische Technologien strategisch sinnvoll genutzt werden. In diesem Sinne wurde der Einsatz einer “MS-based biomarker discovery pipeline” vorgeschlagen, in welcher potentielle Biomarker zunächst mit globalen Proteomicsmethoden in klinisch relevanten Patientenproben identifiziert werden. Nachfolgend kann eine große Anzahl ausgewählter Kandidaten gleichzeitig mittels gerichteter Proteomicsmethoden (d.h. SRM-MS) in unabhängigen Patientenproben verifiziert werden. Für die Kandidaten, welche sich erfolgreich in dieser ersten Phase der Verifizierung zeigen, lohnt sich dann eine umfassendere Validierung mittels in der Klinik etablierter Methoden (z.B. ELISA) in großen Patientenkohorten.
Diese Doktorarbeit verfolgte zwei Ziele: Zunächst wurde durch Analyse verschiedener Probenarten der erste direkte Vergleich zweier globaler Proteomicsmethoden erstellt. Für diese Versuche wurden Proben eines hochkomplexen HEK-Zelllysates, einer Membranfraktion aus murinen C2C12 Skelettmuskelzellen sowie einer Körperflüssigkeit (Aszitenflüssigkeit) sowohl mit OFFGEL (12 Fraktionen, pH 3 – 10) gefolgt von RP-LC-MS/MS als auch mittels MudPIT (12 Schritte) analysiert.
Dieser Vergleich zeigte, dass mit OFFGEL eine bessere Fokussierung von Peptiden erreicht werden kann: Je nach Probenart wurden 76 – 88 % aller Peptide nach OFFGEL-LC-MS/MS Analyse in nur einer Fraktion detektiert. Nach MudPIT Experimenten hingegen waren Peptide weniger gut getrennt, mit nur 36 – 61 % der Peptide detektiert in einem einzigen Analyseschritt. Trotz besserer Peptidfokussierung durch OFFGEL waren die mit beiden Methoden erzielten Ergebnisse in Hinblick auf die Anzahl detektierter Proteine für die C2C12 Membranfraktionsproben (1428 Proteine identifiziert mit MudPIT, 1398 mit OFFGEL-LC-MS/MS) und die Aszitenflüssigkeitsproben (346 Proteine mit MudPIT, 461 mit OFFGEL-LC-MS/MS) durchaus vergleichbar. Im Fall der hochkomplexen HEK Proben jedoch führte die bessere Peptidfokussierung anscheinend zu einer höheren Anzahl durch OFFGEL-LC-MS/MS detektierter Proteine (3143 vs. 2242 mit MudPIT). Anhand der analysierten C2C12 Membranfraktionen wurde gezeigt, dass beide Methoden gleichermaßen für die Analyse hydrophober Transmembranproteine geeignet sind.
Fazit dieser Experimente war, dass die Wahl der geeigneten Methode von den Anforderungen des jeweiligen Projektes abhängt: die hochautomatisierte MudPIT-Methode könnte für Routineanalysen, z.B. in begrenzten Probenvolumina, vorteilhaft sein. Dagegen könnte für Studien, die einen hohen Grad an Peptidtrennung erfordern, die zeit- und kostenintensivere OFFGEL-Methode favorisiert werden.
Das zweite Ziel dieser Arbeit war eine proof-of-principle Anwendung einer “MS-based biomarker discovery pipeline” zur Identifizierung potentieller Proteinbiomarker am Beispiel von serösem Ovarialkrebs.
Zunächst konnte durch Analyse von Aszitenflüssigkeit von Ovarialkrebspatientinnen mittels OFFGEL-LC-MS/MS und MudPIT eine umfassende Beschreibung des Proteoms dieser Probenart, bestehend aus über 500 Proteinen, erstellt werden. Zusätzlich wurde per MudPIT ein semi-quantitativer Vergleich zwischen Aszitenflüssigkeit von Krebspatientinnen sowie von Frauen mit gutartigen Tumoren der Ovarien durchgeführt, wobei die relative Menge einzelner Proteine mit Hilfe von Spectral Counting abgeschätzt wurde. Dieses Experiment identifizierte 43 Proteine, welche in den Patientinnenproben im Vergleich zu den Kontrollen gehäuft auftraten. Nachfolgend wurde durch Vergleich dieser experimentellen Daten mit publizierten transkriptomischen und proteomischen Datensätzen eine Liste von 51 potentiellen Ovarialkrebsbiomarkern erstellt.
Für 13 dieser 51 Kandidaten wurden mit Hilfe von synthetischen Peptidstandards SRM-MS Methoden zur Quantifizierung entwickelt. Basierend auf Ergebnissen aus SRM-MS Messungen in Aszitenflüssigkeit wurden nachfolgend vier dieser Kandidaten für eine genaue Quantifizierung mittels SID-SRM-MS in unabhängigen Aszitenflüssigkeits- (n=10) sowie Serumproben (n=20) ausgewählt. Diese Messungen ergaben eine leichte (~2x), jedoch statistisch signifikante Konzentrationserhöhung der drei Kandidaten MSLN, GAPDH und PKM1/2 sowohl in Aszitenflüssigkeits- als auch in Serumproben von Krebspatientinnen im Vergleich zu Kontrollen. Die Ergebnisse zeigen, dass der verwendete Pipeline-Ansatz als Studiendesign zur Identfizierung potentieller Biomarker dienen kann. Darüberhinaus liefern die Ergebnisse weitere Hinweise für eine Beteiligung der identifizierten Biomarkerkandidaten an der Pathogenese von Ovarialkrebs. |
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